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CRISPR/Cas 系統(tǒng)全稱為常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。這一系統(tǒng)是源于細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，被研究人員開發(fā)為能夠在特定DNA位點(diǎn)進(jìn)行靶向編輯的工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由Cas9內(nèi)切酶和sgRNA組成：Cas9內(nèi)切酶蛋白：含RuvC和HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域，具有切割雙鏈DNA的功能，能識(shí)別PAM基序（5’-NGG），并在PAM基序上游第3個(gè)堿基處切割雙鏈DNA。sgRNA：為tracrRNA和crRNA部分序列互補(bǔ)配對(duì)組成的復(fù)合物；其中tracrRNA負(fù)責(zé)與Cas9蛋白結(jié)合，而crRNA攜帶外來(lái)核酸識(shí)別序列（spacer）。基因編輯中，為了方便實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及提高gRNA的穩(wěn)定性，將tracrRNA和crRNA融合成一條RNA，稱為sgRNA。
CRISPR/Cas9遞送工具
在實(shí)際應(yīng)用中，可通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、腺相關(guān)病毒（AAV）、慢病毒等病毒包裝，外泌體包裝，LNPs包封等方式向胞內(nèi)或體內(nèi)或胞內(nèi)遞送質(zhì)粒、Cas蛋白和sgRNA、mRNA和sgRNA、環(huán)狀RNA（circRNA）和sgRNA等，從而在體內(nèi)或胞內(nèi)表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)，達(dá)到基因編輯的目的。
各種形式各有優(yōu)缺點(diǎn)，circRNA的表達(dá)形式是其中最優(yōu)前景和發(fā)展?jié)摿Φ摹?/p>
1.質(zhì)粒
優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)穩(wěn)定，成本低，易于制造；
缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率低；整合到基因組的風(fēng)險(xiǎn)大；Cas蛋白較大，導(dǎo)致質(zhì)粒堿基數(shù)多，更增加了病毒包裝難度。
2. Cas蛋白和sgRNA復(fù)合物
優(yōu)點(diǎn)：方法相對(duì)直接，起效快；
缺點(diǎn)：復(fù)合物降解速度快；蛋白較大且RNPs復(fù)合物電荷特性使遞送效率低；較純的活性Cas蛋白耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，還涉及細(xì)菌內(nèi)毒素污染問(wèn)題。
3. mRNA和sgRNA
優(yōu)點(diǎn)：獲取較易，可通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到；與質(zhì)粒相比起效更快；脫靶概率更低；免疫原性較低；胞內(nèi)存留時(shí)間短，安全性更高；
缺點(diǎn)：mRNA不穩(wěn)定，很容易降解。
4. 環(huán)狀RNA（circRNA）和sgRNA
優(yōu)點(diǎn)：與質(zhì)粒相比起效更快，脫靶效率低，獲取較易，安全性更高，可體外制備得到（具備線性mRNA的所有優(yōu)點(diǎn)）；與線性mRNA相比，circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性更高，半衰期更長(zhǎng)。線性RNA的免疫原性可能干擾蛋白的產(chǎn)生，并觸發(fā)清除編輯細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此，免疫原性更低的circRNA是基因編輯元件更合適的介質(zhì)。因此，circRNA在基因編輯中具有重要的應(yīng)用前景。
缺點(diǎn)：目前對(duì)RNA療法的應(yīng)用開發(fā)主要集中在線性mRNA，circRNA應(yīng)用的開發(fā)研究仍然較少，還只是停留在概念層面，研究者對(duì)circRNA的翻譯能力和體外制備仍持保留意見。
CRISPR/Cas9的優(yōu)勢(shì)
1. 高效性和精確性：CRISPR/Cas9技術(shù)能夠以高效且精確的方式進(jìn)行基因編輯，尤其在識(shí)別和靶向基因的特定位點(diǎn)時(shí)具有極高的準(zhǔn)確性。
2. 多重基因編輯：可以同時(shí)編輯多個(gè)基因位點(diǎn)，這在功能基因組學(xué)研究中非常重要。
3. 適應(yīng)性廣泛：CRISPR/Cas9技術(shù)可應(yīng)用于多種生物系統(tǒng)，包括細(xì)菌、酵母、植物、動(dòng)物以及人類細(xì)胞。
4. 簡(jiǎn)單易操作：與其他基因編輯技術(shù)相比（如ZFN和TALEN），CRISPR/Cas9的操作更加簡(jiǎn)單，時(shí)間更短，成本更低。
CRISPR/Cas9 的應(yīng)用
1. 基因敲除（Knockout）：通過(guò)NHEJ修復(fù)機(jī)制，CRISPR/Cas9可以引入小的插入或缺失突變，從而破壞基因的功能，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞或生物體中敲除特定基因的目的。這對(duì)研究基因功能和疾病模型的建立非常有用。
2. 基因編輯和基因修復(fù)：通過(guò)HDR修復(fù)機(jī)制，研究人員可以使用CRISPR/Cas9引入特定的DNA序列以修復(fù)突變基因或插入新的基因。這種應(yīng)用在遺傳疾病治療中具有巨大潛力。
3. 基因激活或抑制（CRISPRa/CRISPRi）：使用失活的Cas9（dCas9）蛋白，該蛋白無(wú)法切割DNA但仍能靶向特定序列。通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子，dCas9可用來(lái)上調(diào)或下調(diào)特定基因的表達(dá)，而不改變基因序列。
4. 疾病模型的建立：通過(guò)基因敲除或敲入技術(shù)，CRISPR/Cas9可以用來(lái)創(chuàng)建患有特定基因突變的動(dòng)物模型，用于研究人類疾病的發(fā)生機(jī)制，尤其是癌癥、神經(jīng)退行性疾病和遺傳性疾病。
5. 基因組大規(guī)模篩選：通過(guò)CRISPR/Cas9進(jìn)行基因組范圍內(nèi)的基因敲除篩選，可以發(fā)現(xiàn)與某種生物過(guò)程或疾病相關(guān)的關(guān)鍵基因。這種技術(shù)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和功能基因組學(xué)研究中尤為重要。
6. 基因治療：通過(guò)對(duì)病毒的定向基因編輯，可治療感染性疾??；通過(guò)構(gòu)建腫瘤模型、靶向敲除致癌基因位點(diǎn)、恢復(fù)抑癌基因活性、減少腫瘤細(xì)胞耐藥性、激活腫瘤免疫等治療腫瘤疾病；通過(guò)在突變位點(diǎn)處或附近切割DNA雙鏈，同時(shí)誘導(dǎo)不同類型的插入，導(dǎo)致基因刪除、突變、敲入、反轉(zhuǎn)等，可治療遺傳疾??；利用基因編輯解決異種器官移植中的問(wèn)題。
7. 分子診斷：利用 Cas9高特異性識(shí)別并結(jié)合雙鏈DNA(dsDNA)的特性，結(jié)合PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)靈敏度更高、特異性和普適性更強(qiáng)的核酸分子檢測(cè)。
8. 抗體生產(chǎn)：將動(dòng)物免疫分子基因編輯為人類或異種基因，將解決異源抗體免疫排斥的問(wèn)題。
9. 培育新品種：通過(guò)定向改造生物，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物、畜牧家禽、水產(chǎn)品等新品種培育。
參考文獻(xiàn)：
https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR_gene_editing