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免疫印跡（western blotting）是利用抗原抗體特異反應(yīng)特性，定性檢測(cè)樣本中目的蛋白表達(dá)量；是檢測(cè)基因蛋白表達(dá)量最常用的方法，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研領(lǐng)域。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
在電場(chǎng)作用下，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將總蛋白根據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，然后將其轉(zhuǎn)印至固相載體（硝酸纖維膜或PVDF膜）。載體膜與特異識(shí)別特定抗原的抗體孵育后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗特異結(jié)合。最后加入辣根過氧化物酶底物顯色（暗室曝光或化學(xué)發(fā)光成像），結(jié)合顯色條帶光密度分析目標(biāo)蛋白表達(dá)量。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 總蛋白提取
2.1.1 組織樣本：組織塊用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，去除血污，稱重，剪成小塊置于勻漿管中，加入勻漿珠，每10 mg組織加入100 μL組織裂解液（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），設(shè)置勻漿程序進(jìn)行勻漿。勻漿結(jié)束后，放置冰上孵育30 min，每隔5 min震蕩1次確保組織完全裂解。12000 rpm，4 ℃，離心10 min，收集上清，即為組織總蛋白溶液。
2.1.2 細(xì)胞樣本：棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入適量4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，并棄去洗滌液。按說明書加入適量裂解液（含PMSF和磷酸酶抑制劑）至培養(yǎng)板中，使用移液器吹打混勻，冰上孵育20 min。 裂解完成后，用移液器將裂解液移至2 mL離心管中，并4 ℃，12000 rpm，離心10 min，收集上清，利用BCA法測(cè)定蛋白溶液濃度，并且將各組樣本蛋白濃度均一化，調(diào)整至相同濃度。保存上清于-20 ℃或-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
2.2 凝膠電泳
2.2.1制膠: 根據(jù)所要分析的蛋白質(zhì)分子量大小配制分離膠，沿玻璃板上的左上角位置連續(xù)平穩(wěn)注入兩層玻璃板中，待分離膠聚合凝固后，灌注濃縮膠溶液并立即插入膠梳，充分聚合后即可使用。
2.2.2蛋白變性：取出細(xì)胞裂解液按比例加入5×Loading Buffer混勻，于沸水中煮沸5 min，立即冰上放置。
2.2.3上樣電泳：正確放置電泳槽，加入電泳液，上樣，先恒壓80 V電泳25 min，待溴酚藍(lán)指示蛋白壓縮完成后，將電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)快要到達(dá)凝膠底部。
2.3 電轉(zhuǎn)移
將凝膠玻璃板從電泳槽中取下，切去不用的部分，根據(jù)凝膠的尺寸剪裁和凝膠一樣大小的固相膜，再放入電轉(zhuǎn)膜液中浸泡激活；同時(shí)剪裁2張濾紙，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中泡透。按陰極→濾紙→凝膠→固相膜→濾紙→陽極的順序放置在轉(zhuǎn)膜儀上，趕壓氣泡。接通電源，選擇恒流模式，按1.5 mA/cm2凝膠計(jì)算轉(zhuǎn)膜用電流，轉(zhuǎn)膜45 min。
2.4 免疫反應(yīng)
2.4.1 將膜用TBST沖洗5 min后，移至用TBST配置的5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下?lián)u床上封閉2 h。
2.4.2 將一抗用抗體稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度，從封閉液中取出膜，再放入新抗體孵育袋中，加入一抗液，擠趕氣泡，封口，4 ℃ 孵育過夜。
2.4.3 次日取出膜，用TBST在室溫下?lián)u床上洗滌3次，每次5 min。
2.4.4 根據(jù)一抗準(zhǔn)備相應(yīng)種屬二抗稀釋液并與膜一起孵育1 h。
2.4.5 轉(zhuǎn)移二抗稀釋液，用TBST在室溫下?lián)u床上洗3次，每次5 min。
2.4.6 顯色液A、B液比例為1：1，化學(xué)發(fā)光，采集照片，保存原始圖片。
3. 結(jié)果示例
該結(jié)果反應(yīng)了不同樣本，在相同處理及檢測(cè)條件下能清晰的看出蛋白表達(dá)情況。（右圖為對(duì)照內(nèi)參GAPDH）
使用紅外熒光的高質(zhì)量和低質(zhì)量的蛋白質(zhì)印跡圖像的一個(gè)例子。用DMSO(CTL)或2 μM的MEK抑制PD0325901(MEKi)處理WM793黑色素瘤細(xì)胞18 h。選用的是兔抗磷酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204)、小鼠抗總ERK1/2。第一個(gè)Western blot面板是同時(shí)檢測(cè)磷酸化ERK1/2(800nm通道-綠色)和總ERK1/2(700nm通道-紅色)熒光信號(hào)的疊加。第二個(gè)和第三個(gè)面板是磷酸化和總ERK1/2的單通道熒光圖像的黑白圖像。
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