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ChIP（Chromatin Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱染色質(zhì)免疫沉淀）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，可以真實(shí)地反映體內(nèi)蛋白因子與基因組DNA結(jié)合的狀況。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化，以及DNA的鑒定。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
在活細(xì)胞狀態(tài)下通過固定細(xì)胞將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物交聯(lián)在一起，并通過酶處理的方式將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過特異性抗原抗體反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息，找出蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組位點(diǎn)。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎
取出在培養(yǎng)板中培養(yǎng)的細(xì)胞，加入甲醛，使得甲醛的終濃度為1%；37°C孵育10 min后終止交聯(lián)，吸盡培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次。接著用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于兩個(gè)15 ml離心管中，離心棄上清，進(jìn)行超聲破碎。
2.2除雜及抗體孵育
超聲破碎結(jié)束后，離心去除不溶物質(zhì)，在100 μL的超聲破碎產(chǎn)物中，各加入900 μL ChIP Dilution Bufer、20 μL × PIC和60 μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4 °C顛轉(zhuǎn)混勻1 h后，4 °C靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，取上清。各留取20 μL做為input。一管中加入1 μL抗體，另一管中則不加抗體。4 °C顛轉(zhuǎn)過夜。
2.3檢驗(yàn)超聲破碎的效果
取100 μL超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 μL 5 M NaCl，65 °C處理2 h解交聯(lián)后分出一半用酚/氯仿抽提。
2.4免疫復(fù)合物的沉淀及清洗
孵育過夜后，每管中加入60 μL ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA，4 °C顛轉(zhuǎn)2 h。靜置10 min后，離心棄上清，清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入洗滌溶液，在4 °C顛轉(zhuǎn)10 min，再4 °C靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，棄上清。清洗完畢后，開始洗脫。解交聯(lián):每管中加入20 μL 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）混勻，65 °C解交聯(lián)過夜。
2.5 DNA樣品的回收
解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1 μL RNAaseA(MBI)，37 °C孵育1 h。每管加入10 μL 0.5 M EDTA、20 μL 1 M Tris.HCl（pH6.5）2 μL10 mg/mL蛋白酶K。45 °C處理2 h。最后回收DNA片段。
2.6 PCR、qPCR 或者測(cè)序分析。
3. 結(jié)果實(shí)例
此結(jié)果圖，陽(yáng)性對(duì)照組條帶清晰無雜帶，陰性對(duì)照組正常，表明ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。Input對(duì)照組條帶清晰可見，表明PCR擴(kuò)增引物可用于該指標(biāo)的檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)
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