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在外泌體研究中，外泌體鑒定是繼分離之后的關(guān)鍵步驟。其目的是為了判斷樣本是否含有外泌體，是否可以表達(dá)特異性的外泌體標(biāo)志蛋白，是否落在外泌體常規(guī)的粒徑范圍。為了更好的進(jìn)行生物學(xué)功能學(xué)、形態(tài)學(xué)研究和生物標(biāo)記研究，需要對(duì)分離后的外泌體來(lái)進(jìn)行鑒定。我們鑒定的方法主要有透射電鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）和蛋白標(biāo)志物檢測(cè)（western blotting）。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
外泌體透射電鏡鑒定外泌體大小、形態(tài)，可觀(guān)測(cè)樣本中是否存在外泌體樣結(jié)構(gòu)（通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形）；通過(guò)粒子直徑分析系統(tǒng)測(cè)算和統(tǒng)計(jì)樣品中粒子的直徑分布，能保證外泌體原始狀態(tài)；將外泌體蛋白裂解后，通過(guò)蛋白標(biāo)志物CD9，CD63，TSG101的檢測(cè)，來(lái)確定外泌體中是否有相關(guān)蛋白的表達(dá)。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 TEM鑒定
首先將外泌體用戊二醛固定，之后將5-10 μL外泌體溶液滴加到銅網(wǎng)上，室溫吸附10 min左右，用濾紙小心吸去多余的液體。然后向銅網(wǎng)上滴加10 μL 2%的磷鎢酸溶液 ( pH=6.5 )，在室溫下對(duì)外泌體染色處理2 min，小心用濾紙吸去多余的染色液，將銅網(wǎng)在室溫下晾干，上機(jī)檢測(cè)。
2.2 NTA鑒定
分離好的外泌體，樣本取用量一般在2 μL-100 μL不等，上機(jī)檢測(cè)，zetaview軟件可以分析獲取特定粒徑區(qū)間內(nèi)的顆粒濃度。
2.3蛋白標(biāo)志物檢測(cè)
將外泌體，按照Western boltting實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)行CD9、CD63、TSG101三個(gè)標(biāo)志物檢測(cè)。
3. 結(jié)果示例
Western boltting檢測(cè)結(jié)果顯示提取的外泌體可成功檢測(cè)到標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101的表達(dá)。
上圖NTA結(jié)果是經(jīng)AuNPs處理的人巨噬細(xì)胞釋放的外泌體，顯示了外泌體分布、濃度（絕對(duì)計(jì)數(shù)）和折射率的匯總。
通過(guò)電鏡檢測(cè)抽提到的外泌體形態(tài)和大小判斷，抽提到為外泌體。
參考文獻(xiàn)
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