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細(xì)胞增殖（cell proliferation）是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)，是生活細(xì)胞的重要生理功能之一，是生物體的重要生命特征。細(xì)胞增殖是評(píng)價(jià)細(xì)胞代謝、生理和病理狀況的重要指標(biāo)，常用的檢測(cè)方法有BrdU染色、EdU染色和克隆形成等。
一、Brdu/EdU染色
1. 實(shí)驗(yàn)原理
BrdU（5-Bromo- 2’-deoxuuridine）是胸腺嘧啶的衍生物，可替代胸腺嘧啶選擇性整合到新合成的DNA中（細(xì)胞周期S期）。這種摻入可以穩(wěn)定存在，并隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞中。利用BrdU特異性抗體可以檢測(cè)摻入的BrdU，進(jìn)而判斷細(xì)胞的增殖能力。EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA復(fù)制時(shí)期代替胸腺嘧啶摻入正在合成的DNA分子中，并基于Apollo?熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即可直接地檢測(cè)出細(xì)胞的增殖能力。雖然BrdU和Edu兩種方法都能檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，但兩者也有不同。Brdu抗體較大，必須先對(duì)DNA進(jìn)行部分變性形成單鏈，才能與BrdU結(jié)合進(jìn)而完成檢測(cè)；而EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性即可有效檢測(cè)，可有效地避免樣品損傷，具有更高的靈敏度和更快的檢測(cè)速度。
2. 實(shí)驗(yàn)原理圖
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 BrdU染色
3.1.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞（具體密度取決于細(xì)胞的生長(zhǎng)率）接種到96孔板中，待細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理；
3.1.2 添加配制的 10× BrdU溶液到平板孔中，以獲得1×的最終濃度。
3.1.3 將細(xì)胞放入恒溫器。一般的孵育時(shí)間為 1-24 h；
3.1.4 去除培養(yǎng)基。如是懸浮細(xì)胞，則以300 g的離心力離心10 min，隨后棄去培養(yǎng)基；
3.1.5 按100 μL/孔添加 Fixing/Denaturing Solution，并將平板放在室溫下
靜置30 min，棄去溶液；
3.1.6 按100 μL/孔添加配制的1×BrdU抗體溶液，并將平板放在室溫下1 h；
3.1.7 棄去溶液，用 1× Wash Buffer洗滌 3 次；
3.1.8 按 100 μL/孔添加配制的1× HRP標(biāo)記二抗溶液，并將平板放在室溫下 靜置30 min，棄去溶液；平板用1× Wash Buffer洗滌 3 次。
3.1.9 添加 100 μL TMB Substrate；
3.1.10 室溫孵育30 min；
3.1.11 添加 100 μL STOP Solution；
3.1.12 讀取在450 nm處的吸光度（要獲得最佳讀數(shù)，則在添加 STOP Solution 30 min內(nèi)讀取平板）。
3.2 EdU染色
3.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
3.2.1.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞（具體密度取決于細(xì)胞的生長(zhǎng)率）接種到96孔板中，待細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理；
3.2.1.2 配制2× EdU工作液，37 ℃預(yù)熱后，等體積加入96孔板中，使96孔板中的EdU終濃度變?yōu)?×。更換所有的培養(yǎng)液可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液；
3.2.1.3 繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h。該孵育時(shí)間的長(zhǎng)短取決于細(xì)胞生長(zhǎng)速率，通常孵育時(shí)間為該細(xì)胞周期的10%左右；
3.2.1.4 EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，棄去培養(yǎng)液，并加入1 mL固定液，室溫固定15 min。
3.2.1.5 棄去固定液，每孔用1mL洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。
3.2.1.6 棄去洗滌液，每孔用1mL通透液室溫孵育15 min。
3.2.1.7 棄去通透液，每孔用1mL洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次5 min。
3.2.2 EdU檢測(cè)
96孔板中每孔的反應(yīng)體系為50 μL的反應(yīng)混合物，6、12、24、48和384孔板對(duì)應(yīng)的反應(yīng)混合物體系分別為500 μL、200 μL、100 μL、70 μL和20 μL。
3.2.2.1去除上述孔中的洗滌液，每孔加入50 μL Click反應(yīng)液（參考下表組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，并且在配制后15 min內(nèi)使用），輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品；
3.2.2.2 室溫避光孵育30 min。
3.2.2.3 吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次5分鐘。
3.3.3 細(xì)胞核染色
為了檢測(cè)細(xì)胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色。
3.3.3.1 吸除洗滌液后，每孔加1×Hoechst 33342溶液1mL，室溫避光孵育10分鐘。
3.3.3.2 吸除1× Hoechst 33342溶液。
3.3.3.3 用洗滌液洗滌3次，每次5分鐘。
3.3.3.4 隨后即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。Hoechst 33342為藍(lán)色熒光，最大激發(fā)波長(zhǎng)為346 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm
4. 結(jié)果示例
Edu標(biāo)記正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下呈綠色；Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞核，顯微鏡下呈藍(lán)色；綠色細(xì)胞數(shù)占藍(lán)色細(xì)胞數(shù)的比值表示正在進(jìn)行復(fù)制的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例，其數(shù)值越高，表示細(xì)胞的增殖能力越強(qiáng)。對(duì)照組中未檢測(cè)出正在增殖的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到處于復(fù)制的細(xì)胞。
二、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)
1. 實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、侵襲性、對(duì)殺傷因素敏感性等項(xiàng)目的重要技術(shù)方法。所謂克隆就是當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體。細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，克隆形成率差別也很大。一般正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞克隆形成率強(qiáng)?？寺⌒纬梢罁?jù)采用的培養(yǎng)介質(zhì)的不同，分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于貼壁的細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于懸浮的腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。
2. 實(shí)驗(yàn)原理圖
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 平板克隆形成
3.1.1 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)；
3.1.2 培養(yǎng)板(6孔板)中接種400-1000個(gè)細(xì)胞/孔（根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況確定，一般為700個(gè)細(xì)胞/孔）；
3.1.3 繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)；
3.1.4 棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min；
3.1.5 用PBS洗滌1次，每孔加入結(jié)晶紫染液1mL，染細(xì)胞10-20 min；
3.1.6 用PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，相機(jī)拍照（分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照）；
3.2 軟瓊脂克隆形成
3.2.1 配制1.2%和0.7%瓊脂糖，高壓滅菌后，維持在42 ℃使其保持融化狀態(tài)；
3.2.2 將1.2%瓊脂糖膠與2×培養(yǎng)基1：1混合，鋪入6孔板作為下層膠，每孔1.5 mL，室溫等其凝固；
3.2.3 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL；
3.2.4 將0.7%瓊脂糖膠與2×培養(yǎng)基1：1混合，加入100 μL細(xì)胞懸液，混合均勻后，加入6孔板作為上層膠，每孔1.5 mL。
3.2.5 待其凝固后，再在上面加入培養(yǎng)基，每3天更換一次；
3.2.6 根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度培養(yǎng)2-3周后顯微鏡下觀察克隆大小，與平板克隆一樣，每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞，顯微鏡拍照。若拍整個(gè)孔，每孔加入200 μL氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）染色，37 ℃過(guò)夜，拍照。
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
平板克隆形成。細(xì)胞克隆形成后，經(jīng)結(jié)晶紫染色呈藍(lán)色；在相同的接種細(xì)胞數(shù)量下，細(xì)胞克隆的數(shù)量越多，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。
軟瓊脂克隆形成。顯微鏡下可以看到分散的細(xì)胞克隆，克隆數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的比值可以衡量細(xì)胞的增殖能力；比值越高，增殖能力越強(qiáng)。
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