| EN
RIP實(shí)驗(yàn)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀）是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過程的有力工具，可應(yīng)用于研究miRNA調(diào)節(jié)靶點(diǎn)、RNA與RBPs（RNA結(jié)合蛋白）的互作關(guān)系等。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，主要是運(yùn)用針對目標(biāo)蛋白的抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，通過免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，將復(fù)合物中的RNA純化出來后就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗(yàn)證或者測序分析。
2. 實(shí)驗(yàn)流程圖
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 獲取細(xì)胞裂解液
3.1.1 冷PBS清洗培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞兩次。
3.1.2 加入冷PBS后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來，收集至離心管中。
3.1.3 1500 rpm，4 ℃離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。
3.1.4 用與細(xì)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xì)胞，吹打均勻后于冰上靜置20 min。
3.1.5 每管分裝200 μL細(xì)胞裂解液，貯存于-80 ℃。
3.2 制備磁珠-抗體
3.2.1 吸取50 μL 重懸后的磁珠懸液于每個(gè)離心管中，每管加入500 μL RIP Wash Buffer，渦旋震蕩。
3.2.2 將離心管置于磁力架上，去上清，重復(fù)洗滌一次。
3.2.3 用100 μL的RIP Wash Buffer重懸磁珠，加入適量抗體，室溫孵育30 min。
3.2.4 將離心管置于磁力架上，棄上清加入500 μL RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復(fù)一次。
3.2.4 將離心管置于磁力架上，加入500 μL RIP Wash Buffer，混勻后置于冰上備用。
3.3 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀
3.3.1 將3.2.4的離心管放磁力架上，去上清，每管加入900 μL RIP Immunoprecipitation Buffer
3.3.2 迅速解凍3.1.5制備的細(xì)胞裂解液，離心，吸取100 μL上清液于磁珠-抗體復(fù)合物中，使得總體積為1 mL。
3.3.3 4 ℃孵育3 h或過夜孵育。
3.3.4 短暫離心，將離心管放在磁力架上，棄上清。
3.3.5 加入500 μL RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后將離心管放在磁力架上，棄上清，重復(fù)清洗3-5次。
3.4 RNA純化
3.4.1 用150 μL Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復(fù)合物，55 ℃孵育30 min。
3.4.2 孵育完之后，將離心管置于磁力架上，將上清液吸入一新的離心管中。
3.4.3 于每管上清液中加入250 μL RIP Wash Buffer，再加入400 μL苯酚：氯仿：異戊醇，渦旋震蕩，室溫下14 000 rpm離心10 min。
3.4.4 小心吸取350 μL上層水相，吸入另一新的離心管，于每管加入400 μL氯仿，渦旋震蕩15 s，室溫下14 000rpm離心10 min。
3.4.5 小心的吸取300 μL上層水相，吸入另一新的離心管，每管加入50 μL Salt SolutionⅠ，15 μL Salt SolutionⅡ，5 μL Precipitate Enhancer，850 μL無水乙醇（無RNase）混合，-80 ℃保持1 h至過夜，14 000 rpm，4 ℃離心30 min，小心去上清。
3.4.6 用80%乙醇沖洗一次，14 000 rpm，4 ℃離心15 min，小心去上清，空氣中晾干，用10-20 μL DEPC水溶解，-80℃保存，可用于后續(xù)q-PCR驗(yàn)證或者測序分析。
4. 結(jié)果示例
RIP 分析與本氏煙草中柑橘銀屑病病毒 (CPsV) 的 24K 或 54K GFP 融合蛋白相關(guān)的前體。 進(jìn)行 RT-qPCR 以確定本氏煙草 pre-miR156a (a) 或 pre-miR171a (b) 的積累水平
參考文獻(xiàn)
[1]. Gagliardi M, Matarazzo MR. RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 2016;1480:73-86.
[2]. Jayaseelan S, Doyle F, Tenenbaum SA. Profiling post-transcriptionally networked mRNA subsets using RIP-Chip and RIP-Seq. Methods. 2014 May 1;67(1):13-9.
[3]. Zambelli F, Pavesi G. RIP-Seq data analysis to determine RNA-protein associations. Methods Mol Biol. 2015;1269:293-303.
[4]. Nicholson CO, Friedersdorf MB, Bisogno LS, Keene JD. DO-RIP-seq to quantify RNA binding sites transcriptome-wide. Methods. 2017 Apr 15;118-119:16-23.