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RNA pull-down是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)可以富集并鑒定或驗(yàn)證與目標(biāo)RNA有相互作用的蛋白質(zhì)。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
RNA沉降（Pull down）主要是檢測(cè)蛋白質(zhì)與RNA之間的相互作用。RNA pull down 是使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。收集從磁珠上洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)，可通過(guò)質(zhì)譜和Western Blot來(lái)確定和驗(yàn)證與RNA互作的蛋白。
2. 實(shí)驗(yàn)流程圖
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 生物素探針標(biāo)記RNA
3.1.1 取出RNA 3' End Desthiobiotinylation試劑盒，將試劑盒中的PEG及DMSO置于常溫，其余組分置于冰上融化；
3.1.2 依照RNA母管含量，用DEPC水溶解RNA，將濃度調(diào)整至10 μg/管，用10 μL DEPC水溶解。同時(shí)溶解試劑盒中Control RNA作為陰性對(duì)照；
3.1.3 取對(duì)照RNA及目標(biāo)RNA各5 μL，放于200 μL的PCR管中，每管可加1 μL DMSO，混勻后置于PCR儀上，85 ℃，5 min，然后立即置于冰上5 min；
3.1.4 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系
3.1.5 混勻上述反應(yīng)體系，之后放至PCR儀內(nèi)，16 ℃，4 h至過(guò)夜。反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)可提高連接效率；連接反應(yīng)結(jié)束后，向每管加400 μL nuclease free-water；
3.1.6 每管加300 μL酚氯仿提取標(biāo)記成功的RNA；渦旋后最大轉(zhuǎn)速離心15 min，小心將上層水相移取到新的EP管中；
3.1.7 加10 μL 5 M NaCl，2 μL糖原，以及600 μL預(yù)冷的100%乙醇，放于-20 ℃或-80 ℃沉淀，可沉淀過(guò)夜。
3.2 準(zhǔn)備細(xì)胞裂解液
3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)在15 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80-90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3次，吸去上清；
3.2.2 每個(gè)培養(yǎng)皿中加入200 μL cell lysis buffer；
3.2.3 用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至EP管，冰上放置30 min；
3.2.4 離心，4 ℃，3000 rpm，離心10 min；
3.2.5 將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管中，置于冰上；加200 U/mL RNase Inhibitor;
3.2.6 取10-20 μL左右上清至新管中，作為實(shí)驗(yàn)input。
3.3 RNA沉淀
3.3.1 將沉淀過(guò)夜的RNA取出，4 ℃，最大轉(zhuǎn)速離心30 min，離心后可見(jiàn)管底的白色沉淀為RNA；
3.3.2 小心移取上清，用1 mL 70%乙醇洗滌，8000 rpm 離心10 min,之后吸凈管內(nèi)液體，空氣中晾干RNA；
3.3.3 每管加20 μL nuclease free-water溶解RNA，之后將RNA放于PCR儀中，95 ℃，5 min使其變性，之后立即置于冰上，備用。
3.4 磁珠預(yù)處理
3.4.1 取50 μL磁珠至離心管中，置于磁力架上，吸去上清。加入1 mL 20 mM的Tris-HCl（pH7.5），清洗磁珠后置于磁力架上，吸去上清，重復(fù)洗一次。
3.4.2 用800 μL 1×binding & washing buffer，洗3次，吸去上清；
3.5 RNA 與beads結(jié)合
3.5.1 向的beads中加入400 μL 2×binding & washing buffer；
3.5.2 向上一步中加入50 pmol已標(biāo)記的RNA，再補(bǔ)380 μL DEPC水，使其終體積為800 μL；
3.5.3 室溫慢速旋轉(zhuǎn)30 min，使beads與RNA充分結(jié)合；
3.5.4 將上一步的管子置于磁力架上，吸去上清；
3.5.5 用800 μL 1×binding & washing buffer（含RNase Inhibitor, 1 U/ μL），洗3次，去除上清；
3.5.6 用cell lysis buffer A洗一次beads，吸去上清，注意不要讓beads干掉。
3.6 RNA與蛋白相互作用檢測(cè)
3.6.1 向上一步已處理好的beads中每管加入500 μL細(xì)胞裂解液；同時(shí)每管加入1 U/ μL濃度的RNase Inhibitor；
3.6.2 4 ℃慢速旋轉(zhuǎn)2 h，使beads與細(xì)胞裂解液充分結(jié)合；
3.6.3 置于磁力架上吸去上清，用400 μL新鮮配制的cell lysis buffer A（+RNase Inhibitor+蛋白酶抑制劑），洗5次beads;
3.6.4 吸去上清，加入50 μL的Elution buffer，輕輕將磁珠吹勻，置于37 ℃孵育30 min，置于磁力架上，收集上清，做Western blot檢測(cè)或者質(zhì)譜檢測(cè)。
4. 結(jié)果示例
該實(shí)驗(yàn)中，beads組作為陰性對(duì)照，AR 3'UTR RNA能夠?qū)uR下拉，表明與HuR之間有相互作用。
參考文獻(xiàn)
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