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ELISA，即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。 ELISA是將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一種綜合性技術(shù)，其作為免疫標(biāo)記技術(shù)（包含免疫熒光技術(shù)，免疫放射技術(shù)，免疫酶技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)）中的一種，已廣泛應(yīng)用于科研和臨床實(shí)驗(yàn)中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特點(diǎn)。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
ELISA主要基于抗原或抗體的兩個(gè)特點(diǎn)：1）固定在載體表面的抗原或者抗體不會(huì)失活，仍然保留其免疫反應(yīng)性；2）酶標(biāo)記的抗體或者抗原既具有免疫學(xué)活性，還具有酶的催化活性的特點(diǎn)。ELISA的基本原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過(guò)物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標(biāo)本，通過(guò)酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法和步驟可有多種，包含用于檢測(cè)抗體的間接法，用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法，以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等。比較常用的是雙抗體夾心法和間接法。
雙抗體夾心法是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無(wú)關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)，然后加入含有抗原之待測(cè)樣品，通過(guò)加入酶標(biāo)記特異性抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測(cè)物的濃度呈正相關(guān)。該方法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
間接法是將一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入無(wú)關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)后，加入待測(cè)樣本，然后加入酶標(biāo)二抗，經(jīng)孵育和洗滌后，加底物顯色。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。主要用于對(duì)病原體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。
2. 實(shí)驗(yàn)流程圖
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 雙抗體夾心法檢測(cè)抗原
3.1.1包被：用0.05 M PH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10 μg/mL。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 mL，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。
3.1.2 加樣：加一定稀釋的待測(cè)樣本0.1 mL于上述已包被的反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h后洗滌。需同時(shí)設(shè)置空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。
3.1.3 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1 mL。37 ℃孵育0.5~1 h后洗滌。
3.1.4 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)用現(xiàn)配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃ 避光顯色10-30 min。
3.1.5 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 mL。
3.1.6 測(cè)定：在ELISA檢測(cè)儀上，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后 15 min以?xún)?nèi)進(jìn)行。
3.2間接法測(cè)定抗體
3.2.1 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1-10 μg/mL，每孔加0.1 mL，4 ℃過(guò)夜。次日洗滌3次。
3.2.2 加一定稀釋的待測(cè)樣本0.1 mL于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h，洗滌，同時(shí)設(shè)置空白孔、陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。
3.2.3 于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體0.1 mL，37 ℃孵育30-60 min。最后用DDW洗滌。
3.2.4 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入現(xiàn)用現(xiàn)配的TMB底物溶液0.1 mL，37 ℃ 避光顯色10-30 min。
3.2.5 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 mL。
3.2.6 測(cè)定：在ELISA檢測(cè)儀上，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后 15 min以?xún)?nèi)進(jìn)行。
4. 結(jié)果示例
如圖，將標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后，通過(guò)測(cè)量OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)測(cè)量樣品的OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度
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