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細(xì)胞系（cell line）指原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體，也指可長(zhǎng)期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細(xì)胞。耐藥細(xì)胞系是通過模擬癌癥患者在化療期間所經(jīng)歷的條件而開發(fā)的，與親代細(xì)胞系相比，耐藥細(xì)胞系表現(xiàn)出2-8倍的抗性。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系指的是基于某一細(xì)胞系構(gòu)建的持續(xù)過表達(dá)或干擾某特定基因的細(xì)胞系，包括敲降（KD）細(xì)胞系、敲除（KO）細(xì)胞系、敲入（KI）細(xì)胞系。
一、耐藥細(xì)胞系構(gòu)建
1. 實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞與低劑量的藥物長(zhǎng)期接觸，引起細(xì)胞本身藥物化學(xué)過程的改變，細(xì)胞膜上出現(xiàn)P-糖蛋白等耐藥相關(guān)蛋白，使細(xì)胞逐漸對(duì)藥物耐受。具有抗性的細(xì)胞大量繁殖并產(chǎn)生抗性后代，隨著藥物濃度的遞增，其耐受程度逐漸加強(qiáng)，從而構(gòu)建出對(duì)特定藥物產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞系。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度鋪板于96孔板，過夜培養(yǎng)后檢測(cè)藥物的半抑制濃度（IC50）；
2.2 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（匯合度80%-90%），加入起始濃度為低濃度（建議為親本細(xì)胞株的IC50的1/10-1/5）的藥物進(jìn)行處理，并置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2.3 待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)密度再次恢復(fù)至80%-90%時(shí)，重復(fù)上述藥物處理6-8次；
2.5 待細(xì)胞在此濃度穩(wěn)定生長(zhǎng)后，依次提高藥物濃度，并按照同樣的方式進(jìn)行處理，直到細(xì)胞能夠在最終的藥物濃度穩(wěn)定生長(zhǎng)，獲得耐藥細(xì)胞系；
2.6 檢測(cè)耐藥細(xì)胞株的IC50，并計(jì)算耐藥指數(shù)（resistance index, RI），RI=耐藥細(xì)胞系的IC50/親代細(xì)胞系的IC50，RI>5則認(rèn)為耐藥細(xì)胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
在相同的藥物及藥物濃度處理下，耐藥細(xì)胞HCT116/b-AP15比母本細(xì)胞HCT116的細(xì)胞存活率及IC50都要高。
二、KD/KO/KI穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建
1. 實(shí)驗(yàn)原理
將外源基因克隆到具有某種抗性的載體上，通過轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，外源基因整合到宿主染色體上，用載體中所含抗性基因進(jìn)行篩選即可得到成功整合目的基因的細(xì)胞系。慢病毒感染方法是目前最常用的穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建方法，其具有高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)、宿主范圍廣，感染效率高的優(yōu)勢(shì)，且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細(xì)胞系的理想方法。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 將目的基因構(gòu)建到合適的慢病毒載體上，利用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得含目的基因的慢病毒；
2.2 轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度控制在80%左右；
2.3 第二天加入適量病毒懸液感染細(xì)胞，并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育；
2.4 24 h后用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)；
2.5 在轉(zhuǎn)染3-4天后開始加藥篩選培養(yǎng)，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
帶有GFP基因的病毒感染細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可以觀察到大量的細(xì)胞表達(dá)熒光，獲得大量的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。
參考文獻(xiàn)
[1] Tandon N, Thakkar KN, LaGory EL, Liu Y, Giaccia AJ. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018 Nov 5;8(21):e3073.
[2] Milone MC, O'Doherty U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 2018 Jul;32(7):1529-1541.
[3] Maes ME, Colombo G, Schulz R, Siegert S. Targeting microglia with lentivirus and AAV: Recent advances and remaining challenges. Neurosci Lett. 2019 Aug 10;707:134310.
[4] Amaral MVS, DE Sousa Portilho AJ, DA Silva EL, DE Oliveira Sales L, DA Silva Maués JH, DE Moraes MEA, Moreira-Nunes CA. Establishment of Drug-resistant Cell Lines as a Model in Experimental Oncology: A Review. Anticancer Res. 2019 Dec;39(12):6443-6455.
[5] Li HL, Xie SM, Zhang L, Cai CJ, Wang W, Huang J, Wang DY, Wen DP, Deng QH, Zhong NS, He JX. Establishment and characterization of a new drug surviving cell line Am1010, derived directly from muscle metastases of a human lung adenocarcinoma patient with multi-drug-resistance to cisplatin, taxol, and gefitinib. Acta Pharmacol Sin. 2010 May;31(5):601-8.