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Co-IP（co-immunoprecipitation，免疫共沉淀）被認(rèn)為是識(shí)別或確認(rèn)體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用事件發(fā)生的經(jīng)典方法之一。該方法可以利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白或復(fù)合體，能夠特異性富集所研究的目標(biāo)蛋白，由于過(guò)程中采用了非變性條件，保留了互作蛋白或復(fù)合體的胞內(nèi)自然狀態(tài)。
1. Co-IP實(shí)驗(yàn)原理
當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y、Z等蛋白也能富集下來(lái)。目前多將protein A/G預(yù)先結(jié)合固化在磁珠上，使之與含有抗原和抗體的溶液孵育后，磁珠上的protein A/G就能通過(guò)抗體吸附抗原達(dá)到富集和篩選鑒定互作分子的目的。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，也用于探索特定蛋白質(zhì)的新的互作搭檔。
2. 實(shí)驗(yàn)流程圖
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 免疫復(fù)合物的制備
3.1.1收集細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解液于4 ℃，最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；將每個(gè)樣品的細(xì)胞裂解液取部分與推薦量的IP抗體一起加入至1.5 mL離心管中，剩余細(xì)胞裂解液保留作為下游Western blot分析的input，除實(shí)驗(yàn)樣品外，可設(shè)置IgG和beads組作為對(duì)照。
3.1.2用免疫沉淀裂解/漂洗緩沖液將抗體/裂解液稀釋至500 μL。
3.1.3在室溫下孵育1-2 h，或4 °C過(guò)夜，以形成免疫復(fù)合物。
3.2 免疫共沉淀
3.2.1將適量偶聯(lián)蛋白A/G的磁珠加入到1.5 mL 離心管中。
3.2.2向含有磁珠的離心管中加入適量免疫沉淀裂解/漂洗緩沖液，輕柔顛倒離心管數(shù)次進(jìn)行混勻。
3.2.3將離心管放入磁力架中收集磁珠到離心管的一邊，去除上清。
3.2.4重復(fù)2-3步驟2-3次。
3.2.5將抗原樣品/抗體混合物（步驟A）加入盛有磁珠的離心管中，保持混勻室溫下孵育1-2 h。
3.2.6用磁力架收集磁珠，除去未結(jié)合的樣品，保存以備分析。
3.2.7向離心管中加入適量免疫沉淀裂解/漂洗緩沖液，輕柔混勻，收集磁珠，棄上清。再重復(fù)洗滌3-5次。
3.2.8低pH洗脫：向離心管中加入適量洗脫液。保持混勻在室溫下孵育10分鐘。通過(guò)磁力架分離磁珠，保留含有目的蛋白的上清。
3.2.9含目的蛋白的上清液加入適量蛋白電泳上樣緩沖液后可用于Western blot分
析或蛋白質(zhì)譜鑒定。
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
Co-IP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TssC41和TssB之間的相互作用，RpoA作為陰性對(duì)照蛋白，TssC41能夠?qū)ssB拉下來(lái)，反過(guò)來(lái)TssB也能將TssC41拉下來(lái)
參考文獻(xiàn)
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