| EN
活體成像技術(shù)(in vivo imaging technique) 是指在不對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成傷害的前提下，應(yīng)用影像學(xué)方法，利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器對(duì)活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)者可借此技術(shù)非侵入式、直觀地觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移、疾病的發(fā)展過程、基因的表達(dá)變化等生物學(xué)過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同時(shí)間點(diǎn)各種生物學(xué)行為進(jìn)行跟蹤觀察。因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等領(lǐng)域。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
1.1光學(xué)原理
光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域，大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測(cè)到。在相同的深度情況下，檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織并且可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量。
1.2標(biāo)記原理
目前活體成像技術(shù)主要采用生物發(fā)光（Bioluminescence）與熒光（Fluorescence）兩種技術(shù)。
生物發(fā)光技術(shù)是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，將熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或者DNA，即將熒光素酶基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。
基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù)，將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后，觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物—熒光素。熒光素脂溶性非常好，很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，利用生物光學(xué)分子成像系統(tǒng)，應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，可觀測(cè)并記錄到這些光子。
熒光技術(shù)是應(yīng)用熒光蛋白（如綠色熒光蛋白GFP， 紅色熒光蛋白DsRed等熒光報(bào)告基團(tuán)）標(biāo)記細(xì)胞或蛋白，通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，熒光基團(tuán)吸收激發(fā)光后產(chǎn)生熒光形成體內(nèi)的生物光源，通過高靈敏度的儀器對(duì)發(fā)射光進(jìn)行檢測(cè)的方法。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1細(xì)胞標(biāo)記
2.1.1質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化
制備帶有熒光素luc轉(zhuǎn)酶報(bào)告基因或編碼熒光蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行擴(kuò)增純化。
2.1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目標(biāo)細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%孔培養(yǎng)板中，TM即可轉(zhuǎn)染。進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，將目標(biāo)細(xì)胞、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及足量的質(zhì)粒載體懸浮液共培養(yǎng)6h，之后補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)液。
2.1.3單克隆細(xì)胞篩選
轉(zhuǎn)染48h后用胰酶消化細(xì)胞，以1:6比例接種到6孔板中，同時(shí)加入抗生素G418，隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細(xì)胞抗性克隆的出現(xiàn)。分別挑選單一抗性克隆至96孔板，待其逐漸增殖后轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。
2.1.4熒光素酶活性鑒定陽性克隆，篩選穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株
單一抗性克隆傳代至第五代時(shí)用LuciferaseAs-sayAystem檢測(cè)熒光素酶活性。檢測(cè)時(shí)，各克隆按1×105個(gè)/孔接種到24孔板，24h后細(xì)胞裂解液裂解，12000r，4℃離心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl熒光素酶96microplateluminometer連續(xù)讀底物，停留2s后，取10s的熒光值（RLU），每個(gè)克隆設(shè)3個(gè)復(fù)孔，保留RLU值高的細(xì)胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性最高的幾個(gè)克隆MCF-7-luc即為陽性克隆。將篩選出高效表達(dá)，陽性率接近100%的細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。
2.2構(gòu)建動(dòng)物模型
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標(biāo)記的細(xì)胞。
2.3活體成像
2.3.1小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開啟照明燈拍攝第一次背景圖。
2.3.2自動(dòng)關(guān)閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動(dòng)物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。熒光成像應(yīng)選擇合適的激發(fā)和發(fā)射濾片，生物發(fā)光則需要成像前體內(nèi)注射底物激發(fā)發(fā)光。
2.3.3利用軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
利用生物發(fā)光成像方法對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型小鼠中非侵入性地測(cè)量不同時(shí)間點(diǎn)大腦和脊髓中的生物發(fā)光，并在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠以評(píng)估臨床和病理變化。采用Pearson相關(guān)分析統(tǒng)計(jì)生物發(fā)光與臨床病理EAE的相關(guān)性。
4. 參考文獻(xiàn)
[1] Luo, J. , Ho, P. , Steinman, L. , & Wyss-Coray, T. . (2008). Bioluminescence in vivo imaging of autoimmune encephalomyelitis predicts disease. Journal of Neuroinflammation,5,1(2008-02-01), 5(1), 6.
[2] Syed, A. J. , & Anderson, J. C. . (2021). Applications of bioluminescence in biotechnology and beyond. Chemical Society Reviews, 50,5668.
[3] Pogue, B. W. , Zhang, R. , Cao, X. , Jia, J. M. , & Vinogradov, S. A. . (2021). Review of in vivo optical molecular imaging and sensing from x-ray excitation. Journal of Biomedical Optics, 26(1).