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外泌體（Exosomes）是指包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150 nm），其特指直徑在40-100 nm的盤狀囊泡。多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，這些外泌體通過轉(zhuǎn)運關(guān)鍵蛋白和遺傳物質(zhì)，在細胞通訊和表達遺傳中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。通常采用離心法來進行外泌體分離。
1. 實驗原理
利用分子的大小比重物理原理和多聚物的沉淀原理，使用離心法分離外泌體是至今為止最常用的方法。 此方法可大量提取、成本低、操作簡單、耗時短。分離的外泌體可作為治療靶標(biāo)、藥物或基因載體以及作為疾病標(biāo)志物的應(yīng)用，還在細胞與細胞間的物質(zhì)和信息傳遞中起著重要的作用。
2. 實驗步驟(不同樣品分離步驟不同，以尿液為例）
2.1 將凍存品于25 ℃水浴中解凍，將完全融化后的樣品置于冰上。
2.2 取25 mL尿液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃，3000 g離心10 min，去除細胞碎片；若沉淀較多，可重復(fù)離心多次至無明顯沉淀，取離心上清液。
2.3 離心上清液轉(zhuǎn)移至50 ml離心過濾柱中；4 ℃，3000 g離心10 min，取過濾柱下室液體；若上室中有殘留液體，可重復(fù)本步驟以獲得更多樣本量。
2.4在離心過濾后的上清液中加入Exosome Concentration Solution （ECS試劑），25 mL尿液加入5 ml ECS。
2.5 渦旋振蕩混勻1 min后放置于4 ℃靜置2 h。
2.6 取出裝有混合液的離心管于4 ℃，10000 g離心1 h，marker筆標(biāo)記沉淀位置，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒，靜置1 min后，再次吸棄上清。
2.7 取Exosome Solution Buffer（ESB試劑）均勻吹打離心沉淀物，25 mL尿液加入0.5 mL ESB，待其溶解后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中。
2.8 4 ℃，12000 g，離心5 min，保留上清液，該上清液中富含外泌體顆粒。分裝保存于-80 ℃；便于后續(xù)實驗。
3. 結(jié)果示例
示意圖（過濾法）：首先去除細胞和細胞碎片，其次，過濾掉游離蛋白，濃縮樣品。最后，去除大于100 nm的細胞外囊泡，得到外泌體。
參考文獻
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