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qPCR（Quantitative Real-time PCR）即實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，利用插入性染料或熒光探針，監(jiān)控PCR過程中的熒光強(qiáng)度以比較樣品間的DNA水平，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。根據(jù)化學(xué)發(fā)光原理可以分為：熒光染料法，TaqMan探針法。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
1.1 熒光染料法
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
1.2 TaqMan探針法
在PCR擴(kuò)增時加入一對引物的同時另外加入一條特異性的TaqMan熒光探針，該探針與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。當(dāng)探針完整時，報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)的空間距離很近，報告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號會被淬滅熒光基團(tuán)吸收，使儀器檢測不到熒光信號。在PCR延伸階段，Taq DNA 聚合酶沿著模板鏈從5'到3'的方向合成新鏈，當(dāng)Taq DNA 聚合酶到達(dá)探針結(jié)合位點(diǎn)時，Taq DNA 聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性將探針5'端連接的報告熒光基團(tuán)切割下來，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，通過檢測PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度可以達(dá)到檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。
2. 實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 總RNA抽提
2.1.1細(xì)胞裂解或組織勻漿
貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)基，一般六孔板每孔加1 mL Trizol，12孔板每孔加0.5 mL Trizol?；蝿?-5下，再用移液器吹打數(shù)次，確保全部裂解，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。
懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每5-10+E6細(xì)胞加入1 mL Trizol。用槍吹打確保全部裂解。
組織：組織塊放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，帶組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按每50-80 mg組織加入1 mL Trizol，轉(zhuǎn)移入離心管。加入Trizol的裂解液室溫放置5 min，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，吸取澄清的Trizol裂解產(chǎn)物（上清液）至新的離心管中，去除不溶物或油脂狀漂浮物。
2.1.2 每使用1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min。
2.1.3 把上層水相轉(zhuǎn)移到新管中，用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，放置-20 ℃冰箱30 min。如果提取microRNA等小RNA，則置于-80 ℃沉淀過夜。
2.1.4 4 ℃ 12 000 rpm離心30 min，在管底可見RNA沉淀。
2.1.5 棄上清，用75%乙醇（DEPC水配制）洗滌RNA沉淀。每使用1 mL Trizo1至少加1 mL75%乙醇。4 ℃,7500 rpm離心5 min。
2.1.6 室溫放置干燥RMA沉淀，大約晾3-5 min。加入32 μL無RNase的水溶解RNA后檢測RNA濃度和純度。
2.2 cDNA合成
反轉(zhuǎn)錄體系
試劑 | 使用量(uL) |
RNA | ≤ 1 μg |
Enzyme Mix | 1 |
5×All-in-one qRT SuperMix | 4 |
RNase Free dH2O | Up to 20 |
上述反應(yīng)體系在PCR儀50 ℃反應(yīng)15 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在85 ℃反應(yīng)5 s使RT酶失活；得到的cDNA產(chǎn)物可保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
2.3 Real Time PCR
2.3.1 引物設(shè)計(jì)在NCBI上進(jìn)行，需在實(shí)驗(yàn)前完成合成。
2.3.2 定量PCR反應(yīng)體系
試劑 | 使用量(uL) |
2×ChamQ Universal SYBR Qpcr Master | 10 |
Primer F(10uM) | 0.5 |
Primer R(10uM) | 0.5 |
Template DNA/cDNA | 1 |
ddH2O | To 20 |
2.3.3 通過上述體系混合配成MIX，加入qPCR管中混勻至管中無氣泡。
2.3.4 兩步法進(jìn)行real time PCR，反應(yīng)程序如下：
2.3.5 待反應(yīng)結(jié)束后保存文件數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析使用雙delta法（計(jì)算方式如下），結(jié)果表達(dá)形式為mean ± SD；使用單因素方差分析法比較兩組數(shù)據(jù)間差異，P< 0.05為差異顯著；?Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；??Ct=各樣品?Ct-對照組?Ct平均值；2-??Ct反應(yīng)各樣品相對于照組目的基因的相對表達(dá)水平
3. 結(jié)果示例
如上圖所示為qPCR的擴(kuò)增曲線，曲線越靠后，Ct值越大。
如上圖所示為qPCR的溶解曲線，曲線單峰說明產(chǎn)物特異性高。
如上圖所示為qPCR結(jié)果圖，數(shù)值越高表明基因相對表達(dá)量越高。
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