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外泌體是由活細胞分泌的直徑約為30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)；參與細胞之間的交流，物質(zhì)的運輸以及正常生理過程的維持，此外還與疾病的產(chǎn)生有關(guān)。外泌體內(nèi)吞示蹤是用示蹤劑 (如有機染料、熒光蛋白、造影劑、核素等) 標記外泌體，用特定的影像學方法對動物體內(nèi)外泌體進行追蹤，從而觀察外泌體在體內(nèi)的生物學行為和檢測靶細胞內(nèi)吞外泌體的情況，并有助于對外泌體的功能進行進一步的研究。目前對于外泌體的常用標記方法是親脂性染料，影像學的常用方法是光學成像。
1. 實驗原理
用于外泌體標記的親脂性染料，可以穩(wěn)定的與細胞膜脂質(zhì)區(qū)結(jié)合并發(fā)出熒光。其中常用的膜蛋白熒光染料是PKH67（綠）/PKH26（紅），與分離的外泌體孵育后，可以標記上外泌體，使外泌體帶上熒光，通過加入熒光標記好的外泌體與靶細胞進行孵育，熒光顯微鏡檢測靶細胞中熒光富集情況，以判斷靶細胞是否可以內(nèi)吞外泌體。影像學的光學成像分為生物發(fā)光成像和熒光成像。其中生物發(fā)光成像是由自身合成的熒光素酶催化人為注射的熒光素底物，而產(chǎn)生的化學發(fā)光成像方法，需要超靈敏相機來檢測。而熒光成像則是利用有機染料或熒光蛋白在外部光源的激勵下發(fā)出信號而成像。
2. 實驗步驟
2.1 親脂性染料標記實驗
2.1.1 外泌體蛋白定量：取適量外泌體進行BCA濃度測定來確定外泌體蛋白量。
2.1.2 染料工作液制備：用Diluent C將PKH67/PKH26 linker儲存稀釋液稀釋10倍，配制濃度為100 μM的染料工作液。
2.1.3 外泌體染色：在外泌體中加入染料工作液（建議10-200 μg外泌體蛋白量加入50 μL染色工作液、10-200 μg外泌體蛋白量加入50 μL染色工作液）。加入染料工作液后，通過渦旋振蕩器混勻1 min，再靜置孵育10 min。向孵育后的外泌體-染料復(fù)合物中加入10 mL的1 × PBS，混勻。按照外泌體提取方法再次提取外泌體以去除多余染料，最后取200 μL的1 × PBS重懸沉淀物，沉淀即為熒光標記好的外泌體。
2.1.4 通過加入熒光標記好的外泌體與靶細胞進行孵育，孵育時間依實驗而定。
2.1.5 熒光顯微鏡下觀察熒光富集情況。
2.2 熒光成像實驗原理與步驟同染料標記相同，但是在熒光量子化、顏色和半衰期等方面有所不同。有機染料的發(fā)射波長范圍為502至734 nm，在選擇合適的探針進行外泌體標記時提供了多種選擇。
2.3 生物發(fā)光成像：根據(jù)實驗需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種用熒光酶標記的細胞，同時在不同時間注射底物激發(fā)發(fā)光，來展現(xiàn)細胞來源外泌體進行成像。
3. 結(jié)果示例
L6細胞共培養(yǎng)后被PKH67標記的外泌體（綠色）吸收。PKH67標記的外泌體定位于L6細胞的細胞核中。
參考文獻
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