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熒光素酶報(bào)告基因（Luciferase reporter）檢測(cè)是以熒光素（luciferin）為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly Luciferase）活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在熒光素氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光，可通過(guò)酶標(biāo)儀等設(shè)備測(cè)定熒光素氧化過(guò)程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于miRNA靶基因驗(yàn)證及啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控等方向研究。
1. 實(shí)驗(yàn)原理
利用熒光素酶與底物結(jié)合發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的特性，把目的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的上/下游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過(guò)熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。雙熒光素酶通常是指螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶。由于單報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)往往會(huì)受到各種實(shí)驗(yàn)條件的影響，而雙報(bào)告基因則通過(guò)共轉(zhuǎn)染的“對(duì)照”作為內(nèi)參為試驗(yàn)提供一基準(zhǔn)線，從而可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，使得數(shù)據(jù)結(jié)果更為可信。
2. 實(shí)驗(yàn)原理圖
2.1 miRNA與靶基因mRNA互作
2.2 轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子互作
3. 實(shí)驗(yàn)步驟
3.1 樣品準(zhǔn)備（根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)不同分組，本實(shí)驗(yàn)以miRNA靶基因驗(yàn)證為例）
3.1.1 將細(xì)胞按50%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)12孔板內(nèi)。
3.1.2 待細(xì)胞長(zhǎng)至約70%時(shí)轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分組4組，空白組（轉(zhuǎn)染試劑+細(xì)胞）、質(zhì)粒組、質(zhì)粒+miRNA NC組、質(zhì)粒+miRNA mimics組。
3.1.3 配制質(zhì)粒組：按照每孔50 ng質(zhì)粒，同時(shí)每孔20 μL無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為A。
3.1.4 配制miRNA NC/mimics：miRNA NC/mimics的終濃度為20 nM，同時(shí)每孔20 μL無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，分別標(biāo)記為B、C。
3.1.5 配制對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑：按照每孔0.5 μL轉(zhuǎn)染試劑，同時(shí)每孔20 μL無(wú)血清培養(yǎng)基計(jì)算需用量，標(biāo)記為D。
3.1.6 稀釋好的四組試劑常溫孵育5 min。
3.1.7 將稀釋好的質(zhì)粒DNA和miRNA mimics分別和對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染試劑混勻，常溫孵育20 min。
3.1.8 將3.1.7步驟中試劑對(duì)應(yīng)加入孔中。
3.1.9 轉(zhuǎn)染6 h后，換新鮮完全培養(yǎng)基。
3.2 雙報(bào)告基因檢測(cè)
3.2.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染36-48 h后，棄去培養(yǎng)基，用100 μL 1×PBS清洗細(xì)胞。
3.2.2 傾斜12孔板，吸干剩余的PBS。
3.2.3 去離子水將5×PLB(裂解液)稀釋成1×PLB（現(xiàn)配現(xiàn)用），使用前放到常溫。
3.2.4 每孔加50 μL稀釋好的 1× PLB，置搖床振搖20-30 min以保證裂解緩沖液完全裂解細(xì)胞。
3.2.5 選用白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟3.2.4的上清液10 μL，加入100 μL預(yù)先混好的Luciferase Assay Reagent II，2 s后測(cè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。
3.2.6 測(cè)定結(jié)束后，每孔添加100 μL預(yù)先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2 s后，測(cè)數(shù)據(jù)，檢測(cè)內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。
3.2.7 記錄讀數(shù)，每個(gè)樣品會(huì)有3個(gè)數(shù)值：RLU1-螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，RLU2-內(nèi)參海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度，計(jì)算兩組數(shù)據(jù)比值，即RLU1/RLU2。
4. 結(jié)果示例
在該結(jié)果中，miRNA-145-5p處理后的ARPC5-WT和MAP4K4-WT的luciferase活性均降低，表明其為miMRNA-145-5的靶基因
參考文獻(xiàn)
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