| EN
細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞為止所經(jīng)歷的過程，通常將子細(xì)胞形成作為一次細(xì)胞分裂結(jié)束的標(biāo)志。細(xì)胞的生命開始于產(chǎn)生它的母細(xì)胞的分裂， 結(jié)束于它的子細(xì)胞的形成，或是細(xì)胞的自身死亡。細(xì)胞凋亡（Apoptosis），或者說程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death），是細(xì)胞內(nèi)建的防御機(jī)制之一，在生物的正常發(fā)育及疾病抵御中起到重要的作用，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，是細(xì)胞為更好地適應(yīng)環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。具體表現(xiàn)為：出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個(gè)連續(xù)過程等。
一、細(xì)胞周期
1. 實(shí)驗(yàn)原理
流式利用不同熒光物質(zhì)標(biāo)記的單克隆抗體，與待測成分作用，然后上流式細(xì)胞儀檢測待測細(xì)胞。待測細(xì)胞隨流動室內(nèi)的流動鞘液排列成單列，一個(gè)個(gè)迅速通過激光聚焦區(qū)，激光在對每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行照射時(shí)可同時(shí)得到前向角散射和側(cè)向角散射2種散射光以及激發(fā)熒光標(biāo)記物發(fā)出的信號，利用這些信號，可計(jì)算出相對含量，從而得到細(xì)胞群的相對比值。細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個(gè)階段。間期又分為三期：即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，執(zhí)行一定生物學(xué)功能（G0期）。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1/ G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量（2N），而G2/ M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量（4N），而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量。因此，通過流式細(xì)胞儀PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時(shí)，可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期。
2. 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)步驟
2.1 細(xì)胞鋪板處理
2.1.1 先將14個(gè)多孔材料置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中浸泡 60 min。
2.1.2 0.25%胰酶37 ℃消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/μL。
2.1.3 浸泡完成后置于24孔超低貼附培養(yǎng)板中，每個(gè)支架滴加 100 μL 細(xì)胞懸液，靜置30 min。
2.1.4 再用移液器將培養(yǎng)孔內(nèi)殘余的培養(yǎng)液吸出并再次滴加在多孔支架上，重復(fù) 4 次以使細(xì)胞可以充分均勻的粘附在多孔支架內(nèi)。
2.1.5 接種完成之后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h，等待細(xì)胞初步粘附。
2.1.6 每孔再次添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基沒過材料置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.1.7 培養(yǎng)時(shí)間到后用胰酶消化，1000 g，離心5 min收集細(xì)胞。加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸，再次離心細(xì)胞，小心去除上清。
2.1.8 加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃ 固定24 h。
2.1.9 1000 g，離心5 min收集細(xì)胞，去除上清，加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸，再次離心后吸除上清。
2.1.10 參考下表配制碘化丙啶染色液：
| 試劑 | 每個(gè)樣品 |
| 染色緩沖液 | 0.5 mL |
| 碘化丙啶染色液（20×） | 25 μL |
| RNase A （50×） | 10 μL |
2.1.11 染色：每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 oC避光溫浴30 min。
2.1.12 流式檢測：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。
2.1.13 使用CellQuest軟件分析細(xì)胞周期。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
前向散射與側(cè)向散射數(shù)據(jù)圖，用于識別單個(gè)細(xì)胞；脈沖形狀分析圖，用于識別細(xì)胞團(tuán)及粘合細(xì)胞；
右下前向散射- PI 信號圖；PI 直方圖。
二、細(xì)胞凋亡
1．實(shí)驗(yàn)原理
Annexin V和PI雙染法是流式檢測細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法，它是基于凋亡的早期細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面這一原理來實(shí)現(xiàn)的。Annexin Ⅴ（膜聯(lián)蛋白 V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合，將Annexin V 進(jìn)行熒光素FITC標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而碘化丙啶（Propidium, PI）是一種可與DNA結(jié)合的染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，便可用來鑒別活細(xì)胞，凋亡細(xì)胞及死亡細(xì)胞。
2.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟
2.2.1 先將14個(gè)多孔材料置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中浸泡 60 min。
2.2.2 0.25%胰酶37℃消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/μL。
2.2.3 浸泡完成后置于24孔超低貼附培養(yǎng)板中，每個(gè)支架滴加 100 μL 細(xì)胞懸液，靜置30 min。
2.2.4 再用移液器將培養(yǎng)孔內(nèi)殘余的培養(yǎng)液吸出并再次滴加在多孔支架上，重復(fù) 4 次以使細(xì)胞可以充分均勻的粘附在多孔支架內(nèi)。
2.2.5 接種完成之后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 h，等待細(xì)胞初步粘附。
2.2.6 每孔再次添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基沒過材料置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.2.7 細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4 ℃離心5 min收集細(xì)胞。
2.2.8 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次300 g，4 ℃離心5 min。
2.2.9 吸棄PBS，加入100 μL 1×Bingding Buffer重懸細(xì)胞。
2.2.10 加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL PI Staining Solution進(jìn)行雙重染色。
2.2.11 避光、室溫反應(yīng)15 min。
2.2.12 加入400 μL 1×Bingding Buffer，混勻放置冰上并立即用流式細(xì)胞儀檢測。
2.2.13 使用CellQuest軟件分析細(xì)胞凋亡的比例。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例
實(shí)驗(yàn)組（左）和對照組（右）經(jīng)Annexin V和PI雙染法流式檢測結(jié)果：Annexin V-FITC單陽為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙陽細(xì)胞為壞死或晚期凋亡細(xì)胞，PI單陽細(xì)胞為裸核細(xì)胞。
參考文獻(xiàn)
[1] Rieger A M, Nelson K L, Konowalchuk J D, et al. Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death[J]. Journal of Visualized Experiments Jove, 2011(50).
[2] Crowley L C, Marfell B J, Scott A P, et al. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry[J]. Cold Spring Harbor Protocols, 2016, 2016(11):pdb.prot087288.
[3] Rieger A M, Barreda D R. Accurate Assessment of Cell Death by Imaging Flow Cytometry[M]. Methods Mol Biol, 2016.
[4] Sawai H, Domae N. Discrimination between primary necrosis and apoptosis by necrostatin-1 in Annexin V-positive/propidium iodide-negative cells[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2011, 411(3):569-573.
[5] Pietkiewicz S, Schmidt J H, Lavrik I N. Quantification of apoptosis and necroptosis at the single cell level by a combination of Imaging Flow Cytometry with classical Annexin V/propidium iodide staining[J]. Journal of Immunological Methods, 2015, 423:99-103.