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細(xì)胞染色是一種通過化學(xué)或其他方法使細(xì)胞著色的技術(shù)，可直觀的了解細(xì)胞生長狀況、形態(tài)等細(xì)胞特性以及其中的分子表達(dá)水平與定位等，它包括細(xì)胞免疫化學(xué)染色、細(xì)胞免疫熒光染色、EdU/BrdU染色、TUNEL染色等。
一、細(xì)胞免疫化學(xué)染色
1．實驗原理
免疫細(xì)胞化學(xué)染色（Immunocytochemistry，ICC）原理是通過引入附有標(biāo)記物的外源性抗體（或抗原），使之錨定與細(xì)胞標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（或抗體）部位，標(biāo)記物經(jīng)呈色反應(yīng)從而顯示待檢抗原（或抗體），根據(jù)標(biāo)記物的不同分為：免疫酶細(xì)胞化學(xué)染色、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色等。
2．實驗原理圖
3．實驗步驟
3.1 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105 個/mL的密度接種于24孔板中，混勻，使其呈單細(xì)胞層，并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；
3.2 棄去培養(yǎng)基，使用PBS漂洗3遍，95%丙酮固定10 min；
3.3 PBS漂洗3次，每次2 min;
3.4 0.3% Triton X-100通透15 min;
3.5 PBS漂洗3次，每次2 min;
3.6 加3%雙氧水，37 ℃反應(yīng)10 min;
3.7 PBS漂洗2次，每次2 min;
3.8 加入10%羊血清封閉，37 ℃孵育30 min；
3.9 吸棄上清，加入一抗，置于濕盒內(nèi)，37 ℃反應(yīng)1 h或 4 ℃冰箱過夜；
3.10 PBS漂洗3次，每次2 min;
3.11 加入多聚物酶標(biāo)記的HRP二抗，室溫孵育30 min;
3.12 PBS漂洗3次，每次2 min;
3.13 加入DAB（3，3-二氧己聯(lián)苯胺）顯色10 min;
3.14 加入PBS清洗2次，終止呈色反應(yīng)；
3.15 加入蘇木精2 min，PBS清洗一次，迅速過鹽酸酒精分化，PBS清洗1次；
3.16 顯微鏡下觀察、拍照。
4．實驗結(jié)果示例
圖a是對照組，只有細(xì)胞核被染成紫色；圖b是實驗組，加入HMOCC-1一抗和酶標(biāo)記的HRP二抗后，細(xì)胞質(zhì)被染成棕色。
二、細(xì)胞免疫熒光染色
1．實驗原理
細(xì)胞免疫熒光（Immunofluorescence，IF）的實驗原理是將已知抗體或抗原標(biāo)記熒光素，用此特異性試劑浸染含有相應(yīng)抗原或抗體的細(xì)胞標(biāo)本，借助抗原抗體特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而定位細(xì)胞中的抗原或抗體。
2．實驗原理圖
3．實驗步驟
3.1 將爬片置于24孔培養(yǎng)板中，并加入對數(shù)生長期細(xì)胞，待細(xì)胞長成單層，取出爬片，用PBS清洗2次（懸浮生長的細(xì)胞離心后用PBS離心洗滌2次，制成細(xì)胞涂片）；
3.2 棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，PBS清洗；
3.3 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min；
3.4 PBS 清洗3次，每次5 min；
3.5 用0.5% Triton X-100滲透5 min，在封閉緩沖液中封閉細(xì)胞60 min；
3.6 吸去封閉緩沖液，加入稀釋后的一抗，4 °C 孵育過夜；
3.7 PBS 漂洗3次，每次5 min；
3.8 加入稀釋好的二抗，置于室溫下濕盒中避光孵育1 h；
3.9 PBS漂洗3次，每次5 min；
3.10 滴加1×DAPI避光孵育10 min，并用PBS漂洗3次，每次5 min；
3.11 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
4．實驗結(jié)果示例
細(xì)胞核被DAPI染成藍(lán)色，而細(xì)胞質(zhì)中的蛋白被特異性抗體檢測出，在熒光顯微鏡下呈紅色。
三、BrdU/EdU染色
1．實驗原理
BrdU（5-Bromo- 2’-deoxuuridine）是胸腺嘧啶的衍生物，可替代胸腺嘧啶選擇性整合到新合成的DNA中（細(xì)胞周期S期）。這種摻入可以穩(wěn)定存在，并隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞中。利用BrdU特異性抗體可以檢測摻入的BrdU。EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA復(fù)制時期代替胸腺嘧啶摻入正在合成的DNA分子中，并基于Apollo?熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即可直接地檢測出處于增殖期的細(xì)胞。
雖然BrdU和EdU兩種方法都能檢測出增殖期細(xì)胞，但兩者也有不同。Brdu抗體較大，必須先對DNA進(jìn)行部分變性形成單鏈，才能與BrdU結(jié)合進(jìn)而完成檢測；而EdU只有BrdU抗體大小的1/500，在細(xì)胞內(nèi)更容易擴散，無需DNA變性即可有效檢測，可有效地避免樣品損傷，具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。
2．實驗原理圖
BrdU染色原理△
EdU染色原理△
3．實驗步驟
3.1 BrdU染色
3.1.1 細(xì)胞以1.5×105/mL接種于直徑35 mm培養(yǎng)皿中（內(nèi)放置一個蓋玻片），培養(yǎng)24 h，用含0.4% FBS培養(yǎng)液同步化3天，使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期；
3.1.2 加入BrdU，使得BrdU的終濃度為0.03 μg/mL，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h;
3.1.3 棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌玻片3次，4%多聚甲醛固定30 min；
3.1.4 PBS洗3次后，加入2 mol/L的HCL，置于37 ℃條件下變性5 min；
3.1.5 加入0.1 mol/L的硼酸鈉中和10 min，PBS洗3次；
3.1.6 加入0.2% Triton X-100通透10 min；
3.1.7 PBS洗3次，加入3% BSA室溫封閉1 h；
3.1.8 PBS洗3次，加入BrdU抗體，4℃過夜孵育；
3.1.9 PBS洗3次，加入二抗，室溫避光孵育1 h；
3.1.10 PBS洗3次，加入1× Hoechst 33342避光孵育10 min；
3.1.11 PBS洗3次，并在熒光顯微鏡下觀察拍照。
3.2 EdU染色
3.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的EdU標(biāo)記及固定、洗滌和通透
3.2.1.1 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1×105個細(xì)胞（具體密度取決于細(xì)胞的生長率）接種到96孔板中，待細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進(jìn)行所需的藥物處理或者其它刺激處理；
3.2.1.2 配制2× EdU工作液，37 ℃預(yù)熱后，等體積加入96孔板中，使96孔板中的EdU終濃度變?yōu)?×。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細(xì)胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液；
3.2.1.3 繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h。該孵育時間的長短取決于細(xì)胞生長速率，通常孵育時間為該細(xì)胞周期的10%左右；
3.2.1.4 EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，棄去培養(yǎng)液，并加入1 mL固定液，室溫固定15 min；
3.2.1.5 棄去固定液，每孔用1mL洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次5 min；
3.2.1.6 棄去洗滌液，每孔用1mL通透液室溫孵育15 min；
3.2.1.7 棄去通透液，每孔用1mL洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次5 min；
3.2.2 EdU檢測
96孔板中每孔的反應(yīng)體系為50 μL的反應(yīng)混合物，6、12、24、48和384孔板對應(yīng)的反應(yīng)混合物體系分別為500 μL、200 μL、100 μL、70 μL和20 μL。
3.2.2.1去除上述孔中的洗滌液，每孔加入50 μL Click反應(yīng)液（參考下表組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，并且在配制后15 min內(nèi)使用），輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品；
3.2.2.2 室溫避光孵育30 min；
3.2.2.3 吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次5分鐘；
3.3.3 細(xì)胞核染色
為了檢測細(xì)胞增殖的比例，可以考慮使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色；
3.3.3.1 吸除洗滌液后，每孔加1× Hoechst 33342溶液1 mL，室溫避光孵育10 min；
3.3.3.2 吸除1× Hoechst 33342溶液；
3.3.3.3 用洗滌液洗滌3次，每次5 min；
3.3.3.4 隨后即可進(jìn)行熒光檢測。Hoechst 33342為藍(lán)色熒光，最大激發(fā)波長為346 nm，最大發(fā)射波長為460 nm。
4. 結(jié)果示例
在熒光顯微鏡下，Hoechst 33342將細(xì)胞核染成藍(lán)色；BrdU抗體結(jié)合到摻入到細(xì)胞DNA中的BrdU，呈綠色。在加dT-QX藥物處理后BrdU陽性染色細(xì)胞比例明顯減少。
四、TUNEL染色
1．實驗原理
TUNEL染色即TdT介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記法（TdT-mediated Dutp Nick-End Labeling），其原理是熒光或者生物素等標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA的3'-OH末端，再通過熒光激發(fā)或者化學(xué)顯色的方法，特異準(zhǔn)確地檢測發(fā)生凋亡的細(xì)胞，而正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。
2．實驗原理圖
3．實驗步驟
3.1 根據(jù)實驗要求對細(xì)胞進(jìn)行處理后，用PBS洗滌1次；
3.2 用4%多聚甲醛固定30 min；
3.3 PBS洗滌1次；
3.4 加入0.2%的Triton X-100，冰浴孵育2 min；
3.5 加入TUNEL反應(yīng)混合液，蓋上蓋玻片，置于暗濕盒中，37 ℃孵育1 h;
3.6 PBS漂洗3次；
3.7 加入DAPI，避光孵育10 min；
3.8 PBS洗3次后，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
4．實驗結(jié)果示例
熒光顯微鏡下，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞呈綠色熒光。
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