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01
不同細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境要求
細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的需求因細(xì)胞類型而異，不僅體現(xiàn)在培養(yǎng)基的不同，還包括生長(zhǎng)空間密度的差異。
某些細(xì)胞在較高密度下更易生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出更好的狀態(tài)，這類細(xì)胞通常生長(zhǎng)速度較慢，如內(nèi)皮細(xì)胞。而其他一些細(xì)胞在低密度下表現(xiàn)更佳，比如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞。
特別是巨噬細(xì)胞，它們的生長(zhǎng)和貼壁速度非?？?，因此在傳代時(shí)需要保留較少的細(xì)胞，以保持良好的狀態(tài)。
巨噬細(xì)胞傾向于聚集生長(zhǎng)，但在不同的細(xì)胞堆之間需要保留一定的空間。如果細(xì)胞過于密集，老化細(xì)胞的數(shù)量會(huì)增加，進(jìn)而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
因此，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需要探索每種細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)密度。
02
應(yīng)對(duì)細(xì)胞形態(tài)不佳的策略
對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)欠佳或表面似有異物，可以在傳代時(shí)嘗試以下操作：
首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3毫升的新培養(yǎng)基（可帶或不帶血清）進(jìn)行清洗，隨后將其吸走。
接著，再加入3毫升培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)吹打，輕輕沿著瓶底吹打一次，然后將其吸走。
這之后再進(jìn)行正式的消化和吹打操作。巨噬細(xì)胞只需吹打，不需要消化。
接下來，將吹打下來的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到預(yù)先加入培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中。
將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱，并定期觀察細(xì)胞貼壁情況，在10分鐘、20分鐘、30分鐘分別檢查一次。
當(dāng)部分細(xì)胞貼壁后，迅速倒出培養(yǎng)基，加入3毫升新培養(yǎng)基，再輕輕清洗一次。
然后，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)。
這種方法被稱為“二次傳代”。
如果一次效果不理想，可以多次重復(fù)這一操作，直至找到細(xì)胞的最佳形態(tài)。需要根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)習(xí)性選擇合適的傳代時(shí)機(jī)。對(duì)于喜歡高密度生長(zhǎng)的細(xì)胞，可以等更多細(xì)胞貼壁后再傳代，反之亦然。這種方法非常有效。
03
培養(yǎng)基的用量
培養(yǎng)基的用量需要根據(jù)具體的細(xì)胞類型進(jìn)行摸索，并非所有情況下都需要按照12毫升或14毫升的標(biāo)準(zhǔn)加培養(yǎng)基。有些細(xì)胞在少量培養(yǎng)基中反而表現(xiàn)更佳。對(duì)于生長(zhǎng)迅速且易于培養(yǎng)的細(xì)胞，少量培養(yǎng)基通常會(huì)使細(xì)胞形態(tài)更好，但需要在換液時(shí)特別注意。
04
培養(yǎng)基該怎樣選？
經(jīng)典或基礎(chǔ)培養(yǎng)基通常為合成培養(yǎng)基，基于天然培養(yǎng)基成分，通過使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行模擬合成，包含氨基酸、碳水化合物、無機(jī)鹽、維生素及其他輔助成分。以下是一些常用培養(yǎng)基及其適用的細(xì)胞類型：
RPMI-1640：廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物、特殊造血細(xì)胞、正?；驉盒栽錾陌准?xì)胞，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，是目前應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基。主要用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞以及HCT-15上皮細(xì)胞等均可參考使用。
吉諾生物-RPMI1640培養(yǎng)液
MEM：它僅含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素。成分簡(jiǎn)單，可廣泛適應(yīng)各種已建成細(xì)胞系和不同地方的哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的培養(yǎng)。
吉諾生物-MEM培養(yǎng)液
DMEM-高糖：是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基，可用于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，更適合高密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。適用于附著性較差，但又不希望它脫離原來生長(zhǎng)點(diǎn)的克隆培養(yǎng)，也可用于雜交瘤中骨髓瘤細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)。
吉諾生物-DMEM高糖培養(yǎng)液
DMEM-低糖：是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基，可用于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。低糖適于依賴性貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，特別適用于生長(zhǎng)速度快、附著性較差的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。
吉諾生物-DMEM低糖培養(yǎng)液
DMEM/F12（1:1）：DMEM/F12培養(yǎng)基適于克隆密度的培養(yǎng)。F12培養(yǎng)基成分復(fù)雜，含有多種微量元素，和DMEM以1:1結(jié)合，稱為DMEM/F12培養(yǎng)基，作為開發(fā)無血清配方的基礎(chǔ)，以利用F12含有較豐富的成分和DMEM含有較高濃度的營(yíng)養(yǎng)成分為優(yōu)點(diǎn)。該培養(yǎng)基適用于血清含量較低條件下哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。為了增強(qiáng)該培養(yǎng)基的緩沖能力，改良之一是在DMEM/F12（1:1）中加入15mM HEPES緩沖液。
吉諾生物-DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液
α-MEM：一般用于培養(yǎng)一些難培養(yǎng)細(xì)胞類型，而其它沒有特殊之處的細(xì)胞株則幾乎均可采用MEM來培養(yǎng)。
吉諾生物-α-MEM培養(yǎng)液
McCoy’s 5A：主要為肉瘤細(xì)胞的培養(yǎng)所設(shè)計(jì)，可支持多種（如骨髓、皮膚、肺和脾臟等）的原代移植物的生長(zhǎng)，除適于一般的原代細(xì)胞培養(yǎng)外，主要用于作組織活檢培養(yǎng)、一些淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以及一些難培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纖維細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、HT-29、BHL-100等上皮細(xì)胞。
吉諾生物-McCoy’s 5A培養(yǎng)液
William’s Medium E：適合大鼠肝上皮細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。
吉諾生物-William’s Medium E培養(yǎng)液
以上為吉諾生物部分培養(yǎng)基產(chǎn)品，更多產(chǎn)品詳情可關(guān)注“吉諾生物”公眾號(hào)~
05
培養(yǎng)瓶的選擇
根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，生長(zhǎng)速度較快的細(xì)胞在玻璃瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)往往優(yōu)于一次性塑料瓶。同一種細(xì)胞在生長(zhǎng)旺盛期，玻璃瓶中的生長(zhǎng)狀態(tài)也更為理想。
這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ扛菀踪N壁，而生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種較為安逸的環(huán)境中反而表現(xiàn)不如玻璃瓶。
因此，若想獲得狀態(tài)更佳的細(xì)胞，可以為生長(zhǎng)速度較慢的細(xì)胞選擇塑料瓶，而對(duì)于生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞或處于生長(zhǎng)旺盛期的細(xì)胞，玻璃瓶可能更為適合。
06
傳代時(shí)的消化操作
傳代時(shí)的消化過程對(duì)細(xì)胞的存活和狀態(tài)至關(guān)重要。許多實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在前幾代生長(zhǎng)良好，但經(jīng)過幾次傳代后，細(xì)胞狀態(tài)開始下降。
這通常是由于消化過程中對(duì)細(xì)胞造成了較大損傷。每次消化時(shí)，所有細(xì)胞都受胰酶作用，但每個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況不同，因此同樣的消化時(shí)間對(duì)所有細(xì)胞是不公平的。
為了解決這個(gè)問題，可以嘗試“四步消化法”：
不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基，加入少量新培養(yǎng)基清洗1-2遍，以去除漂浮的死細(xì)胞等雜質(zhì)，為消化做準(zhǔn)備。
加入少量新培養(yǎng)基吹打，將貼壁不牢固的細(xì)胞吹打下來，再用培養(yǎng)基清洗一次，所得懸液可混合傳代到新瓶中培養(yǎng)，并與后續(xù)消化的細(xì)胞對(duì)比觀察。
清除瓶?jī)?nèi)剩余液體后，加入少量胰酶潤(rùn)洗一遍，然后再加入少量胰酶進(jìn)行消化，同時(shí)在顯微鏡下觀察。
當(dāng)細(xì)胞間出現(xiàn)明顯間隙時(shí)，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打，再傳代到新瓶中培養(yǎng)。此步驟可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行多次。
對(duì)于特別難消化的細(xì)胞，可分批次多次消化，以避免胰酶對(duì)細(xì)胞的過度損傷，保證細(xì)胞的最佳狀態(tài)。
對(duì)于易消化的細(xì)胞，可能只需簡(jiǎn)單操作即可，但對(duì)于難消化的細(xì)胞，需特別注意消化過程的細(xì)節(jié)。
07
換液、傳代與清洗的注意事項(xiàng)
對(duì)于使用DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞，如果在換液時(shí)使用無血清1640進(jìn)行清洗，后續(xù)培養(yǎng)效果通常優(yōu)于直接用DMEM清洗的效果。同樣地，用1640培養(yǎng)的細(xì)胞也有類似的表現(xiàn)。
如果不介意麻煩，可以選擇PBS進(jìn)行清洗，效果與無血清培養(yǎng)基相當(dāng)，有時(shí)甚至更佳。清洗的目的是去除培養(yǎng)瓶中殘留的血清，防止其影響胰酶的消化效果，保證胰酶的最佳活性。
使用PBS清洗后，可以嘗試將細(xì)胞靜置10-15分鐘，等待細(xì)胞逐漸分離，然后再進(jìn)行吹打。這種方法適用于某些細(xì)胞難以消化或胰酶不足的情況下，但需先測(cè)試是否適合你的細(xì)胞。
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
|---|---|---|
| GNM31800-5 | RPMI1640培養(yǎng)液 | 500ml |
| GNM41500-5 | MEM培養(yǎng)液 | 500ml |
| GNM12800-5 | DMEM高糖培養(yǎng)液 | 500ml |
| GNM31600-5 | DMEM低糖培養(yǎng)液 | 500ml |
| GNM12500-5 | DMEM/F12培養(yǎng)液(1:1) | 500ml |
| GNM11900-5 | α-MEM培養(yǎng)液 | 500ml |
| GNM16600-5 | McCoy's 5A培養(yǎng)液 | 500ml |
| GNM41250-5 | William's Medium E | 500ml |
| GNM15050-1 | 0.25%胰酶 含酚紅 | 100ml |
| GNM10010-5 | PBS緩沖液 PH7.4 | 500ml |