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如何識(shí)別細(xì)胞污染？
現(xiàn)象1：細(xì)胞培養(yǎng)液變得渾濁，通常呈現(xiàn)米湯樣的黃色液體，多半是細(xì)菌污染的跡象
圖示 | 細(xì)菌污染
圖示 | 桿菌污染
現(xiàn)象2：培養(yǎng)基內(nèi)有活躍的小黑點(diǎn)，通常是黑膠蟲(chóng)污染的表現(xiàn)。
圖示 | 黑膠蟲(chóng)
現(xiàn)象3：培養(yǎng)基雖然清澈，但可見(jiàn)漂浮的白色毛狀物質(zhì)，這可能是由于真菌感染引起的。
圖示 | 真菌污染
處理方法：如果細(xì)胞污染，建議立即丟棄受污染的培養(yǎng)物，并用酒精棉球徹底清潔培養(yǎng)箱，隨后進(jìn)行半小時(shí)的紫外線消毒，防止二次污染。
此外，初學(xué)者在培養(yǎng)過(guò)程中可以在培養(yǎng)基中加入青霉素和鏈霉素以減少污染風(fēng)險(xiǎn)。
吉諾生物 | 青霉素-鏈霉素溶液（100x）
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞周圍和細(xì)胞表面出現(xiàn)小黑點(diǎn)，應(yīng)該怎么辦？
現(xiàn)象：如果發(fā)現(xiàn)小黑點(diǎn)不動(dòng)，可能是細(xì)胞碎片或支原體污染。
圖示 | 細(xì)胞碎片
圖示 | 支原體污染
處理方法：
對(duì)于懸浮細(xì)胞：收集上清液，低速離心（500~600rpm/min，5~6min），然后更換新的培養(yǎng)瓶。
對(duì)于貼壁細(xì)胞：使用PBS沖洗2~3次，輕拍培養(yǎng)瓶以去除不牢固的碎片，然后棄去PBS。接下來(lái)，使用低濃度的胰酶（如0.05%）消化1分鐘左右，以去除間隙中的碎片，再進(jìn)行正常消化和培養(yǎng)。如果懷疑是支原體污染，建議進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果的細(xì)胞應(yīng)盡快處理并丟棄。對(duì)于珍貴的細(xì)胞，可以嘗試使用支原體清除劑（如泰樂(lè)菌素等）并與其他細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)。
預(yù)防方法：掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī)，避免細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)；控制消化時(shí)間，防止消化過(guò)度產(chǎn)生碎片；減少血清等試劑的凍融次數(shù)；調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH至最佳狀態(tài)；確保水質(zhì)和器皿清潔。
吉諾生物 | PBS緩沖液
細(xì)胞表面有許多死細(xì)胞，傳代時(shí)一直存在，如何應(yīng)對(duì)？
現(xiàn)象：貼壁細(xì)胞表面附著許多死細(xì)胞團(tuán)。
圖示 | 細(xì)胞表面一些死的細(xì)胞團(tuán)
處理方法：經(jīng)過(guò)多次實(shí)踐證明，有效的方法是用PBS沖洗兩次，然后加入胰酶，輕輕晃動(dòng)后立即倒出，再次用PBS沖洗，隨后正常消化。由于死細(xì)胞附著力較弱，第一次加入胰酶后會(huì)脫落，第二次消化的細(xì)胞則是活性較強(qiáng)的。經(jīng)過(guò)2～3次傳代，細(xì)胞狀態(tài)通常會(huì)恢復(fù)良好。
吉諾生物 | 0.25%胰酶（含酚紅）
如果細(xì)胞質(zhì)疏松，細(xì)胞狀態(tài)不佳，如何改善？
處理方法1：更換或提高血清濃度，將其提升至15%～20%，培養(yǎng)48小時(shí)后再換回正常的10%濃度。高濃度血清的長(zhǎng)期使用可能對(duì)細(xì)胞有毒性。
處理方法2：除了調(diào)整血清濃度外，還可以增加細(xì)胞密度，從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至六孔板或十二孔板。高密度培養(yǎng)可以通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
預(yù)防措施：細(xì)胞質(zhì)疏松和老化的主要原因是傳代次數(shù)過(guò)多或胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。控制傳代次數(shù)和消化時(shí)間，避免因消化過(guò)度導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不佳和胞質(zhì)疏松。
細(xì)胞傳代
根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性，傳代可分為懸浮細(xì)胞傳代和貼壁細(xì)胞傳代兩種類型。對(duì)于懸浮細(xì)胞，可以加入等量的新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代，或離心后更換新培養(yǎng)基再吹打分散傳代；貼壁細(xì)胞則采用消化法傳代。以下是傳代培養(yǎng)中的一些注意事項(xiàng)。
圖片
貼壁細(xì)胞傳代時(shí)如何使用胰酶？
通常使用 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na 或 0.05% trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。
若消化液濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片和黑渣子增多。建議常規(guī)細(xì)胞傳代時(shí)使用0.05%胰酶進(jìn)行消化；對(duì)于難消化的細(xì)胞，可采用0.25%胰酶進(jìn)行消化。當(dāng)細(xì)胞密度超過(guò)80%時(shí)，可采用分步消化法。
胰酶應(yīng)儲(chǔ)存在–20°C，解凍在4°C進(jìn)行。首次開(kāi)瓶后，建議分裝于無(wú)菌試管中，避免反復(fù)冷凍解凍以維持胰酶活性，并減少污染機(jī)會(huì)。
如何控制胰酶消化時(shí)間？
胰酶消化過(guò)度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞碎片和黑渣子增多，細(xì)胞大片脫落，嚴(yán)重影響細(xì)胞活性。消化不足則細(xì)胞難以從瓶壁上脫落，反復(fù)吹打可能損傷細(xì)胞。因此，控制胰酶消化時(shí)間尤為重要。
不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性不同，胰酶消化時(shí)間也有所不同。對(duì)于新購(gòu)買的細(xì)胞，建議先用低濃度胰酶摸索消化時(shí)間，每隔1分鐘在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓，并記錄最佳消化時(shí)間，以便下次參考。
如何處理細(xì)胞抱團(tuán)現(xiàn)象？
懸浮細(xì)胞在高密度下容易抱團(tuán)，抱團(tuán)細(xì)胞易死亡并影響周圍細(xì)胞的生長(zhǎng)。可以通過(guò)篩網(wǎng)去除較大的細(xì)胞團(tuán)，或者將細(xì)胞懸液收集到15mL離心管中，靜置20分鐘，小心取上層細(xì)胞上清液繼續(xù)培養(yǎng)（此方法只能去除部分較大的細(xì)胞團(tuán)）。
細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，是否正常？
部分細(xì)胞本身存在一定的空泡，如HepG2，Ishikawa等耐藥株，這屬于正?，F(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)極少空泡，可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整血清濃度、控制消化和傳代時(shí)間來(lái)改善細(xì)胞狀態(tài)。
如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡且數(shù)量較多，可能是細(xì)胞代次較高導(dǎo)致的老化，應(yīng)更換早期代次的細(xì)胞。
細(xì)胞生長(zhǎng)變慢的原因？
·消化過(guò)度
·傳代過(guò)密
·營(yíng)養(yǎng)不良
·細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化
·細(xì)胞存在污染
細(xì)胞不貼壁的原因及解決辦法
胰酶處理時(shí)間：消化不夠會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)，消化過(guò)度則易損傷細(xì)胞膜蛋白，使細(xì)胞貼壁不緊，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。建議縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。
缺少貼壁因子：血清中含有促進(jìn)細(xì)胞貼壁的因子，無(wú)血清培養(yǎng)基中因缺少此類因子，貼壁效果會(huì)下降。解決辦法是更換血清。
污染：支原體或細(xì)菌的污染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不良。應(yīng)分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體，并清潔培養(yǎng)箱。若確認(rèn)污染，應(yīng)丟棄受污染的培養(yǎng)物。
培養(yǎng)液配置或儲(chǔ)存不當(dāng)：培養(yǎng)液pH值過(guò)高或過(guò)低、無(wú)菌操作不當(dāng)?shù)榷紩?huì)影響細(xì)胞貼壁。
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇是維持細(xì)胞株長(zhǎng)期穩(wěn)定性和保存重要細(xì)胞資源的關(guān)鍵步驟。以下是一些細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的要點(diǎn)及注意事項(xiàng)：
細(xì)胞凍存前的準(zhǔn)備工作
細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞處于良好的狀態(tài)，無(wú)污染且生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞密度一般控制在70%-90%之間。建議在傳代1-2天后進(jìn)行凍存，此時(shí)細(xì)胞的活力較高。
培養(yǎng)基的選擇：使用含有10%FBS（胎牛血清）和DMSO（二甲基亞砜）的培養(yǎng)基作為凍存液。通常，凍存液的配方為90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO，或80%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO。
細(xì)胞的收集：對(duì)于貼壁細(xì)胞，使用胰酶消化后收集細(xì)胞，懸浮細(xì)胞則直接離心收集。建議在1000rpm離心5分鐘后棄去上清，加入適量?jī)龃嬉褐匦聭腋〖?xì)胞。
吉諾生物 | 胎牛血清（優(yōu)級(jí)）
凍存操作步驟
分裝：將懸浮好的細(xì)胞液按1-1.5mL體積分裝到凍存管中，確保管口密封良好。
降溫速率：凍存過(guò)程中，降溫速率對(duì)細(xì)胞的存活率至關(guān)重要。通常采用程序降溫法，將細(xì)胞在4°C冷藏10-15分鐘，然后轉(zhuǎn)移到-20°C冷凍30分鐘，再轉(zhuǎn)移到-80°C過(guò)夜。最終，將凍存管移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。通過(guò)緩慢降溫，防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，減少細(xì)胞損傷。
吉諾生物 | 無(wú)血清細(xì)胞凍存液
細(xì)胞復(fù)蘇
復(fù)蘇速度：復(fù)蘇時(shí)應(yīng)盡量快速解凍，以減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損害。通常將凍存管從液氮罐中取出后，立即放入37°C的水浴中，快速搖晃，直至冰塊完全融化。
去除DMSO：細(xì)胞復(fù)蘇后，需盡快去除DMSO。將融化后的細(xì)胞液迅速轉(zhuǎn)移到10mL含有10%FBS的預(yù)溫培養(yǎng)基中，1000rpm離心5分鐘后棄去上清，再加入新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中。
培養(yǎng)觀察：復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，去除死細(xì)胞及殘余DMSO。隨后，按常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞傳代和培養(yǎng)。
細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的常見(jiàn)問(wèn)題
凍存細(xì)胞活力低下：可能與凍存液配方不當(dāng)、降溫速率過(guò)快或復(fù)蘇操作不當(dāng)有關(guān)。建議優(yōu)化凍存條件，確保每一步操作嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁
不良或增殖緩慢：可能是由于DMSO殘留、細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞損傷導(dǎo)致?？梢酝ㄟ^(guò)多次清洗去除DMSO，調(diào)整培養(yǎng)基成分，或在復(fù)蘇初期提高血清濃度，促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)。
凍存細(xì)胞長(zhǎng)期保存的穩(wěn)定性：細(xì)胞在液氮中長(zhǎng)期保存可以維持較高的存活率，但在-80°C長(zhǎng)期保存可能會(huì)影響細(xì)胞活力。建議凍存后盡量在液氮罐中保存。
以上是細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存與復(fù)蘇的詳細(xì)指南，希望對(duì)您的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有所幫助。如果遇到其他問(wèn)題或需要更多建議，歡迎隨時(shí)聯(lián)系吉諾生物！
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
|---|---|---|
GNM15140-1 | 青霉素-鏈霉素溶液(100×) | 100ml |
GNM20012-5 | PBS緩沖液 PH7.2 | 500ml |
GNM15050-1 | 0.25%胰酶 含酚紅 | 100ml |
GNMFBCP5 | 胎牛血清（優(yōu)級(jí)） | 500ml |
GNMA1042 | 無(wú)血清細(xì)胞凍存液 | 100ml |